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【佳學(xué)基因檢測】結直腸癌基因檢測及其他篩選方法

【佳學(xué)基因檢測】結直腸癌基因檢測及其他篩選方法 為什么要推廣結直腸癌的早期基因檢測篩查? 結直腸癌(CRC)是全球最常見(jiàn)和發(fā)病率最高的癌癥之一,也是導致顯著(zhù)死亡率的主要原因。如果結

佳學(xué)基因檢測】結直腸癌基因檢測及其他篩選方法

 


為什么要推廣結直腸癌的早期基因檢測篩查?

結直腸癌(CRC)是全球最常見(jiàn)和發(fā)病率最高的癌癥之一,也是導致顯著(zhù)死亡率的主要原因。如果結直腸癌能在早期被檢測出來(lái),它是可以被治愈的。因此,早期檢測可以降低結直腸癌的死亡率。

結腸鏡檢查已被公認為結直腸癌篩查的金標準,具有高敏感性和特異性。但是,從資金和人力方面來(lái)看,它的成本很高,需要經(jīng)驗豐富的內鏡醫生和患者的配合。分子技術(shù)的進(jìn)步為結直腸癌的檢測和治療提供了幫助。目前,蛋白質(zhì)、DNA(檢測突變和甲基化標記)、RNA(主要是微RNA)、揮發(fā)性有機化合物、腸道菌群組成的變化和轉移都是已被探索的結直腸癌生物標記物類(lèi)別。

根據生物來(lái)源材料或檢測組織的類(lèi)型,佳學(xué)基因可以區分來(lái)自血液和糞便的生物標記物。

如今,結直腸粘液、尿液、唾液和呼出氣體都是額外診斷選擇/生物標記物的來(lái)源。

佳學(xué)基因通過(guò)基因檢測科普討論結直腸癌(CRC)患者腫瘤組織、血液和糞便樣本中新型診斷生物標記物的最新進(jìn)展。
 

血液生物標記物

在癌癥診斷中,生物標記物可能是循環(huán)血液中不同類(lèi)型的生化分子,例如蛋白質(zhì)、腫瘤DNA、來(lái)自腫瘤的細胞和miRNA,所有這些分子在結直腸癌診斷中都被廣泛使用。

這些生物標記物可以通過(guò)基于血液的蛋白定量測試或免疫組織化學(xué)檢測到。局部晚期惡性病變會(huì )使循環(huán)核酸水平提高15倍左右,患有轉移性癌癥的患者濃度可達500ng/m。血液采集或捐獻的便利性意味著(zhù)檢測基于血液的生物標記物可能是結直腸癌篩查的一種實(shí)用工具。

在腫瘤發(fā)生早期,大部分孤立非遺傳性癌癥中就會(huì )出現遺傳異常。攜帶這些異常的大量細胞從發(fā)育中的腫瘤脫落,可以在生物排泄物中發(fā)現,主要是糞便、血清和尿液中的游離核酸。這些遺傳異??梢酝ㄟ^(guò)快速、無(wú)創(chuàng )、相對廉價(jià)且比糞便潛血試驗(FOBT)或糞便免疫化學(xué)試驗(FIT)具有更高敏感性和特異性的分子生物標記物輕松鑒別。

液體活檢

液體活檢可從任何體液(包括外周血液、尿液、腦脊液、腹水、胸腔積液等)中檢測循環(huán)腫瘤細胞,包括基因組或蛋白質(zhì)組評估。這是一種快速、簡(jiǎn)便、低成本且微創(chuàng )的方法,被患者廣泛接受,沒(méi)有重大副作用。

液體活檢(主要使用外周血液)可用作篩查方法檢測早期結直腸癌和手術(shù)后的微小殘留疾病,或確定結直腸癌的分子譜、復發(fā)風(fēng)險、治療靶點(diǎn)、耐藥機制,并可影響早期結直腸癌患者的治療過(guò)程。此外,液體活檢檢測可能允許評估轉移性結直腸癌患者的預后和預測生物標記物。然而,目前液體活檢在結直腸癌中的臨床效用仍然有限。需要對液體活檢評估進(jìn)行更好的標準化和驗證。
 

循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測

循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是來(lái)自原發(fā)腫瘤或轉移灶的上皮癌細胞,進(jìn)入循環(huán)系統并可在外周血液中檢測到。它們可以作為生物標記物來(lái)檢測結直腸癌,或提供有關(guān)擴散機制的信息,從而指導治療決策。目前,廣泛使用的金標準和仍是唯一獲得FDA批準用于循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測的方法,是將免疫磁珠富集與多參數流式細胞術(shù)和免疫細胞化學(xué)分析相結合的高度敏感檢測(CellSearch系統)。然而,循環(huán)腫瘤細胞(CTC)評估存在一些限制,例如血液中循環(huán)腫瘤細胞(CTC)濃度極低,這使得該方法不可靠作為診斷工具。循環(huán)循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的數量范圍為每10mL血液1-10個(gè)細胞,在早期癌癥中可能更低。為了從全血中富集循環(huán)腫瘤細胞(CTC),微加工捕獲室被置于微流控芯片裝置中。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是根據腫瘤細胞和正常血液細胞在大小和形狀上的差異而被分離。結果需要進(jìn)一步的驗證研究。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)在結直腸癌中的預后價(jià)值已被證實(shí),但在篩查中的使用仍存在爭議。另一方面,Tsai等人報告了使用新的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)檢測方法對所有結直腸癌分期(包括癌前病變)的總體準確率為88%。

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)基因檢測

雖然游離DNA(cfDNA)最早是在二十世紀四十年代被發(fā)現的,當時(shí)在癌癥患者的血液中檢測到了非細胞束縛的核酸,但將cfDNA作為診斷生物標記物在日常臨床實(shí)踐中的應用是在二十一世紀開(kāi)始的。在許多研究中,cfDNA在癌癥患者體內的水平都較高。cfDNA片段的長(cháng)度在180到200個(gè)堿基對之間,主要來(lái)源于腫瘤細胞的凋亡或壞死。它們也可能源自存活的腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤細胞。

半胱氨酸蛋白酶是屬于一個(gè)大家族的半胱氨酸蛋白酶,其中還包括絲氨酸、天冬酰胺和金屬蛋白酶。蛋白酶可能通過(guò)降解細胞外基質(zhì)并促進(jìn)腫瘤細胞侵入鄰近正常組織,從而引發(fā)腫瘤疾病的進(jìn)展。半胱氨酸蛋白酶的失調會(huì )導致DNA或核小體釋放入血液循環(huán)。  

cfDNA含有腫瘤特異性的基因組改變,如突變、甲基化、雜合子缺失和微衛星不穩定性。它們在循環(huán)中的半衰期范圍從16分鐘到2.5小時(shí)。實(shí)際上,血清中的cfDNA總量比血漿高24倍,但用于ctDNA分析時(shí)血漿樣本更可取。

除了腫瘤疾病,cfDNA濃度在急性腦損傷、急性缺血性卒中、感染以及器官移植或漸增運動(dòng)后也會(huì )升高。

在血液中對ctDNA進(jìn)行基因分型以確定腫瘤譜系似乎是一種良好的診斷方法。ctDNA檢測是一種快速、簡(jiǎn)便、微創(chuàng )的方法,可實(shí)現全面的組織譜系分析。然而,在晚期癌癥治療選擇方面的有限證據,以及與組織學(xué)或細胞表型的低相關(guān)性是這種方法的主要缺點(diǎn)。

如今,檢測ctDNA有許多常規和納米材料技術(shù),如下一代測序(NGS)、擴增阻遏突變系統(ARMS)、肽核酸夾核酸聚合酶鏈反應(PNA-PCR)、數字滴定PCR(ddPCR)、表面增強拉曼光譜分析的PCR產(chǎn)物(SERS)、基于產(chǎn)生電子信號的電化學(xué)DNA生物傳感器、肽核酸夾核酸不對稱(chēng)PCR和液體芯片(PAPL)、基于微流體裝置的ddPCR分析(IC3D ddPCR)、BEAMing(珠芯、乳化、擴增、磁珠)和Fe-Au納米粒子耦合策略(一種基于雜交的檢測方法)。

ctDNA已被廣泛評估為結直腸癌診斷、預后和治療反應監測的新型液體活檢生物標記物?;赾tDNA檢測的液體活檢是一種非常敏感的檢測方式。Bettegowda等人證實(shí),在一組206例轉移性結直腸癌患者中,ctDNA檢測臨床相關(guān)KRAS基因突變的敏感性為87.2%,特異性為99.2%。
 

循環(huán)微RNA(c-miRNA)

微RNA是一種非編碼RNA的亞類(lèi),最早于20世紀90年代在線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中被發(fā)現和描述。有趣的是,自那以后已經(jīng)描述了超過(guò)38,500種人類(lèi)miRNA。此外,自21世紀以來(lái),循環(huán)miRNA在診斷領(lǐng)域發(fā)揮了作用。

微RNA參與增殖、遷移、分化、造血、細胞周期調控和干性等過(guò)程。miRNA功能失調是多種疾病(如癌癥)的誘因。

微RNA源自?xún)仍葱?、外顯子和內含子序列,來(lái)自于核內的DICER依賴(lài)通路。

最初,RNA聚合酶II(POLR2)或RNA聚合酶III(POLR3)參與miRNA的形成。在生物發(fā)生的第一階段,會(huì )產(chǎn)生幾千個(gè)堿基長(cháng)度、帶有5'帽狀結構和3'多腺苷酸尾的原始轉錄本(pri-miRNA)。隨后,pri-miRNA被由核酶III酶DROSHA和其輔因子組成的微小體加工復合物加工成前體miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA通過(guò)Exportin-5和Ran-GTP轉運至細胞質(zhì)。pre-miRNA被核酶III酶DICER消化,產(chǎn)生成熟miRNA。還有一些miRNA成熟的替代途徑,如DICER獨立的生物發(fā)生、DROSHA/DGCR8獨立的生物發(fā)生、內源性siRNA策略和源自小核小體RNA的miRNA等。

miRNA與RNA誘導的沉默復合物(RISC)相互作用,結合mRNA分子的3'非翻譯區,從而調控轉錄和mRNA穩定性。

循環(huán)miRNA在細胞間起到通訊作用,影響遠端和鄰近靶細胞的基因表達。miRNA參與調控超過(guò)60%的蛋白編碼基因的轉錄后調控。

循環(huán)miRNA主要通過(guò)與外泌體相關(guān)或與Ago2(Argonaute)等蛋白形成復合物的方式進(jìn)行轉運。

與血清相比,miRNA在血漿中的濃度更高。只有極度上調或下調的miRNA似乎適合作為臨床生物標記物。與正常粘膜相比,近三分之二的miRNA在結直腸癌中呈下調。Bartley等人描述了230種miRNA在從大腸非腫瘤性粘膜經(jīng)低級別發(fā)育不良、高級別發(fā)育不良、腺瘤到結直腸腺癌四個(gè)階段轉化過(guò)程中表現出差異表達。

miRNA的失調在腺瘤和結直腸癌中頻繁發(fā)生。因此,它們是潛在的優(yōu)質(zhì)生物標記物來(lái)源。

微陣列技術(shù)使同時(shí)檢測數以千計基因的差異表達成為可能。這項技術(shù)被用于估計結直腸腺瘤和結直腸癌中的miRNA譜變化。樣本的儲存條件非常重要:在全血樣本中,miRNA水平在室溫下至少24小時(shí)保持穩定,而在血清樣本中,miRNA在室溫下會(huì )降解;因此,由于在低溫下核糖核酸酶活性降低,血清miRNA應在4°C下冷藏存儲至多72小時(shí),或在-20°C下冰凍存儲。

反轉錄定量PCR(RT-qPCR)、數字PCR(ddPCR)、基于雜交的技術(shù)(如微陣列、NanoString)和下一代測序(NGS)是用于分析miRNA譜的方法。

建立使用這些標記物的臨床有效的診斷技術(shù)(RNA提取、反轉錄、qPCR分析)以及對它們進(jìn)行優(yōu)化和標準化是很有必要的。

如今,單一miRNA結直腸癌標記物以及在血漿或血清中可檢測到的miRNA標記物組合也作為診斷組被測試。不幸的是,由于單一miRNA在敏感性和特異性方面存在局限性,大多數這類(lèi)研究給出的結果很一般或不太一致。結直腸癌患者和健康受試者單一miRNA分子的水平經(jīng)常重疊。此外,采樣方法應能夠區分癌癥患者和健康個(gè)體。

在前分析階段控制樣本的溶血很有必要,因為溶血可能會(huì )導致含有miRNA的紅細胞破裂,從而改變樣本中循環(huán)miRNA的水平。對于定量結直腸癌循環(huán)miRNA表達的合適內源性標準化物仍缺乏共識。

需要建立處理血液樣本用于miRNA測量的最佳條件(例如,為了避免樣本中的血小板污染)。此外,很難確定循環(huán)miRNA是癌癥特異性還是伴隨疾病特異性。
 

Sept9甲基化基因檢測

啟動(dòng)子CpG島甲基化在結直腸癌病例中比基因突變發(fā)生得更頻繁。過(guò)度甲基化主要通過(guò)誘導轉錄沉默或下調腫瘤抑制基因從而促進(jìn)癌癥發(fā)生。到目前為止,已經(jīng)鑒定出超過(guò)600個(gè)發(fā)生過(guò)度甲基化的基因。對表觀(guān)遺傳學(xué)的更好理解和技術(shù)進(jìn)步使實(shí)驗室研究能夠轉化為日常臨床實(shí)踐工具。

在人類(lèi)中,Sept基因家族有13個(gè)基因(SEPT1-SEPT13)。SEPT9基因位于人類(lèi)17q25染色體上。

最著(zhù)名的血液標記物是SEPT9甲基化DNA。該方法在0-I期結直腸癌患者中的檢測率范圍從57%到64%。將血漿SEPT9啟動(dòng)子區域甲基化檢測與FIT相結合,可將敏感性提高到94%。一項發(fā)表于2017年的納入25篇研究文章的薈萃分析發(fā)現,SEPT9檢測僅在有癥狀人群中優(yōu)于FIT。下一項薈萃分析證實(shí),與早期結直腸癌病例相比,晚期病例mSEPT9陽(yáng)性率更高,結直腸癌陽(yáng)性率也高于腺瘤。診斷敏感性與癌癥部位(左側與右側)無(wú)關(guān),但與受試者的種族有關(guān)(亞洲人群優(yōu)于高加索人群)。2020年發(fā)表的最新薈萃分析顯示,SEPT9檢測在結直腸癌診斷中的敏感性為69%,特異性為92%。

該檢測在發(fā)現癌前病變(高級別腺瘤和息肉)時(shí)表現較差,且是一種昂貴的方法。

2016年,FDA批準Epi proColon試劑盒1.0版(后升級為2.0版)作為篩查工具,用于檢測血漿源性腫瘤DNA中SEPT9啟動(dòng)子區域的甲基化,后者被認為是早期結直腸癌的一種特異性生物標記物。

SEPT9甲基化檢測是一種定性檢測,可根據不同算法的應用被解釋為陽(yáng)性或陰性。陽(yáng)性結果可以通過(guò)以下方式定義:三次PCR中有一次陽(yáng)性(1/3算法)、三次PCR全部陽(yáng)性(3/3算法)、三次PCR有兩次陽(yáng)性(2/3算法)或一次PCR呈陽(yáng)性(1/1算法)。隨著(zhù)需要的陽(yáng)性PCR反應數量的降低,敏感性增加;而隨著(zhù)需要的陽(yáng)性PCR反應數量的增加,特異性增加。

在前瞻性PRESEPT(Prospective Evaluation of SEPT9)研究中,SEPT9甲基化檢測對結直腸癌的敏感性為48%(I期35%,II期63%,III期46%,IV期77%),特異性為92%。對于高級別腺瘤的敏感性非常低(14.4%),僅略高于無(wú)癌患者的假陽(yáng)性率。

由于其在檢測重要癌前病變方面的效力不足,美國預防服務(wù)工作組和美國化學(xué)協(xié)會(huì )目前尚未將Epi proColon檢測納入其結直腸癌篩查指南。
 

長(cháng)非編碼RNA(lncRNA)

在過(guò)去十年里,許多研究者已經(jīng)證明長(cháng)非編碼RNA(lncRNA)在血液中是穩定存在的,并具有診斷潛力。根據長(cháng)度,ncRNA被分為兩類(lèi):小非編碼RNA,長(cháng)度最多200個(gè)核苷酸(如微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、PIWI互作RNA(piRNA));以及長(cháng)非編碼RNA(lncRNA),長(cháng)度為200個(gè)或更多核苷酸,它們可以通過(guò)如染色質(zhì)重塑、染色質(zhì)互作、競爭性?xún)仍葱訰NA和天然反義轉錄物等機制影響癌細胞。由于lncRNA能夠穿過(guò)細胞膜,它們可以在不同的體液中發(fā)現,如血液、血漿/血清或尿液]。它們來(lái)源于以主動(dòng)方式存活的細胞和凋亡細胞。

許多lncRNA與結直腸癌的所有腫瘤發(fā)生和進(jìn)展階段相關(guān)。它們表達水平的改變可能影響多條癌基因信號級聯(lián),包括WNT/β-catenin、PI3K/Akt、EGFR、NOTCH、mTOR和TP53信號通路。有趣的是,循環(huán)RNA直接代表了特定基因的表達水平,可能區分癌癥患者和健康個(gè)體。此外,循環(huán)RNA具有相對抗核糖核酸酶降解的特性。

凋亡小體、微泡和外泌體是包裹于磷脂質(zhì)的細胞外小泡,可隨lncRNA在血液中循環(huán)。這些細胞外小泡由細胞釋放到周?chē)h(huán)境中,其功能是在細胞之間轉移DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖和代謝產(chǎn)物。細胞外小泡分為三個(gè)亞組:直徑50-500nm的凋亡小體由進(jìn)入程序性細胞死亡的細胞釋放;直徑50-1000nm的微泡由細胞膜產(chǎn)生;而外泌體的直徑為30-150nm,源自細胞內部。在三種類(lèi)型的細胞外小泡中,外泌體表達最高水平的長(cháng)微RNA(lmiRNA),并參與多種腫瘤類(lèi)型的化療耐藥性、免疫調節和轉移。據估計,健康人血液中約有2×10^15個(gè)外泌體。癌癥患者的外泌體數量可達4×10^15。分離和富集小泡的最常用方法是超速離心。該方法耗時(shí)且需要大量起始材料和昂貴設備。商業(yè)化的外泌體分離試劑盒缺乏標準化,結果純度較低。

定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)是鑒定循環(huán)miRNA的最常用方法,因其具有高靈敏度和特異性。采用qRT-PCR獲得的數據需要進(jìn)行標準化處理,以避免由于從miRNA提取到擴增過(guò)程中的預分析或技術(shù)因素導致的潛在技術(shù)偏差。不過(guò),目前還沒(méi)有已知的合適的內源性對照或housekeeping基因能夠用于標準化結直腸癌不同血漿或血清樣本中miRNA的表達。Duran-Sanchez等人證實(shí),在溶血和非溶血血清樣本中,miR-1228-3p的檢測結果沒(méi)有顯著(zhù)差異。經(jīng)驗證的miR-1228-3p似乎是一種適當的內源性對照,可用于結直腸癌和高級別腺瘤液體活檢中的循環(huán)miRNA分析。

CCAT1和HOTAIR是最先報道在結直腸癌患者血漿中表達顯著(zhù)升高的標記物。許多其他循環(huán)lncRNA也被描述為結直腸癌檢測的潛在生物標記物(如LOC285194、RP11-462C24.1和Nbla12061、91H、PVT-1和MEG3、NEAT1變體1和NEAT1變體。

薈萃分析試圖總結循環(huán)miRNA在早期結直腸癌檢測中的潛在臨床用途。似乎同時(shí)檢測一整組RNA,而非單個(gè)循環(huán)lncRNA,可以提高這種診斷工具的敏感性和特異性。

 

胰島素樣生長(cháng)因子結合蛋白2(IGFBP-2)

各種生長(cháng)因子,如胰島素樣生長(cháng)因子(IGF-1和IGF-2),可刺激腫瘤生長(cháng)并作為結腸黏膜的有絲分裂原。IGFBP-2是一種結合胰島素生長(cháng)因子2(IGF-2)的細胞外蛋白,參與熱休克蛋白27介導的癌癥進(jìn)展和轉移。IGFBP-2和IGFBP-1均參與細胞增殖調控、分化調控和凋亡抑制。血清IGFBP-2水平升高與結腸的腫瘤性改變存在相關(guān)性,并與結腸癌患者的血漿癌胚抗原(CEA)濃度相關(guān)。因此,評估IGFBP-2水平被建議作為監測結直腸癌患者的一項診斷參數。另一方面,在結直腸癌發(fā)生過(guò)程中,IGFBP-2過(guò)度表達會(huì )通過(guò)抑制細胞增殖而減緩腫瘤生長(cháng)。

丙酮酸激酶M2(PKM2)

PKM2是細胞質(zhì)酶丙酮酸激酶(PK)的一種異構體,參與能量代謝,存在于正常細胞和癌細胞中。PKM2的過(guò)度表達已被報道存在于結直腸癌、胃癌和結腸腺瘤中。

PKM2似乎是一種有用的血液和糞便生物標記物,可用于結直腸癌篩查,具有較高的敏感性[191,193,194,195,196,197,198,199]。這種潛在診斷生物標記物的缺點(diǎn)是特異性較差。

 

Dickkopf3(DDK3)

腫瘤內皮標記物(TEMs)是一組46個(gè)基因,在結直腸癌組織的腫瘤內皮中表達水平高于正常結腸粘膜的內皮。人類(lèi)富含半胱氨酸的Dickkopf家族包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4和一種獨特的Dkk-3相關(guān)蛋白稱(chēng)為Soggy(Sgy),這些都屬于TEMs類(lèi)。

Dickkopf家族是由255-350個(gè)氨基酸組成的糖蛋白,含有一個(gè)核轉運信號序列,并共享兩個(gè)保守的富含半胱氨酸的結構域,每個(gè)結構域都顯示出半胱氨酸和其他保守氨基酸的特征間隔。N-端富含半胱氨酸結構域(以前稱(chēng)為Cys1)是Dkks獨有的,而C-端富半胱氨酸結構域(以前稱(chēng)為Cys2)的半胱氨酸模式與膽鹽酶家族相關(guān)。這兩個(gè)結構域由一個(gè)非保守的連接區分隔開(kāi)。

Wnt信號通路的激活參與了腫瘤發(fā)生,而在結直腸癌中檢測到Wnt拮抗基因等基因的表觀(guān)遺傳沉默。這些拮抗基因是DDK基因,由于啟動(dòng)子區域的過(guò)度甲基化,它們在結直腸癌細胞中被表觀(guān)遺傳沉默。通過(guò)小干擾RNA(siRNA)下調Dkks的表達有助于體外癌細胞的生長(cháng)和侵襲性。
 

DDK3、PKM2、IGFBP-2

該生物標志物模型能以95%的特異性識別早期結直腸癌,對Ⅰ期的敏感性為57%,對Ⅱ期的敏感性為76%。因此,這組生物標志物似乎可作為非侵入式血液篩查和/或診斷測試,在結直腸癌檢測方面與糞便潛血試驗(FOBT)和糞便免疫化學(xué)試驗(FIT)等效。

(責任編輯:佳學(xué)基因)
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